Microscopio electrónico de transmisión
La microscopía electrónica de transmisión (TEM) funciona con muchos de los mismos principios ópticos que la microscopía óptica. Otra ventaja de TEM es su mayor resolución. Este aumento de resolución nos permite estudiar la ultraestructura de orgánulos, virus y macromoléculas. En TEM también se pueden ver muestras de materiales especialmente preparados. La microscopía óptica y la TEM suelen utilizarse juntas para complementar proyectos de investigación.
Debido a que los electrones son tan pequeños y las moléculas de hidrocarburos o gases los desvían fácilmente, el haz de electrones debe usarse en un ambiente de vacío. Para ello se utilizan una serie de bombas para conseguir un vacío suficiente. La bomba rotativa es la primera de la serie. También se les llama “bombas de desbaste” porque se utilizan para reducir inicialmente la presión dentro de la columna a través de la cual deben viajar los electrones hasta el rango de 10 -3 mm Hg. Las bombas de difusión pueden alcanzar vacíos más altos (en el rango de 10 a 5 mm Hg), pero deben estar respaldadas por una bomba rotativa. Las bombas de difusión también mantienen la presión. Además, cuando se requiera un vacío mayor se puede utilizar una turbobomba, una bomba de iones o una criobomba apoyada en las bombas antes mencionadas.
La estructura de un microscopio electrónico de transmisión (TEM) es similar a la de un microscopio óptico.
La fuente de iluminación (o cañón de electrones) en un TEM de emisión termoiónica funciona de manera muy similar a una bombilla. El filamento (cátodo) es la fuente de electrones. Generalmente alambre de tungsteno en forma de horquilla. Se aplica un voltaje de aceleración (una cantidad fija de alto voltaje negativo) a la tapa del cátodo circundante. Luego se aplica una pequeña corriente de emisión al filamento para lograr la liberación de electrones. El punto en el que la pistola logra una buena emisión térmica y una vida útil aceptable del filamento se denomina punto de saturación. La tapa del cátodo (también llamada cilindro Wehnelt) debe ser ligeramente más negativa que el filamento. La resistencia está ubicada en el conjunto de la pistola y está controlada por una perilla denominada “Bias”. Crea una diferencia de voltaje negativa entre el filamento y la tapa del cátodo. Esto hace que los electrones se acumulen dentro de la tapa, formando una “nube” de electrones. El ánodo, ubicado debajo del conjunto de la pistola, está conectado a tierra y ejerce una atracción positiva sobre los electrones cargados negativamente, superando así la fuerza repulsiva negativa de la tapa del cátodo y acelerando a través del pequeño orificio en el ánodo.
Las lentes de vidrio, por supuesto, bloquean los electrones, por lo que las lentes de los microscopios electrónicos (EM) son lentes convergentes electromagnéticas. El alambre de cobre bien enrollado crea un campo magnético, que es la esencia de la lente. Rodeando estas bobinas hay un escudo hecho de metal que no retiene la carga magnética cuando la lente está cerrada. Los electrones pasan a través del orificio central de este solenoide. El camino de los electrones está aún más restringido por revestimientos de latón llamados piezas polares dentro de este espacio. Hay un pequeño espacio dentro de la pieza polar, donde el haz se ve más afectado por la corriente electromagnética. A esto se le llama apropiadamente espacio entre la pieza polar.
La trayectoria de un electrón suele representarse mediante una línea recta que pasa a través de una lente convexa. Sin embargo, más precisamente, la trayectoria del electrón forma una espiral cerrada a medida que se acelera a través de la lente. Cuando un electrón pasa a través de una pequeña abertura en una lente, el camino y la trayectoria que toma se ven afectados por la corriente de la lente.
El punto de cruce es el punto donde convergen los electrones. Esto define la longitud local de la lente.
La función del condensador en un TEM es muy parecida a la de un microscopio óptico. Recogen los primeros electrones de la imagen cruzada y los enfocan en la muestra para iluminar solo el área que se examina. La apertura del condensador se utiliza para reducir la aberración esférica. Las lentes objetivas se utilizan principalmente para enfocar y ampliar inicialmente la imagen. Inserte la etapa de muestra en la lente del objetivo para obtener imágenes. También hay un congelador de dedos o un dispositivo anticontaminación cerca de la lente del objetivo. Consiste en una fina varilla de cobre que se encuentra a la temperatura del nitrógeno líquido, por lo que los contaminantes son atraídos hacia ella. Antes de utilizar el microscopio, el dedo frío debe llenarse con nitrógeno líquido. En ocasiones, los contaminantes pueden provocar un fenómeno llamado deriva. La deriva es el aparente “movimiento” de las muestras en la pantalla. Esto se debe a la acumulación de calor y carga estática debido a un mal contacto entre la rejilla y el portamuestras. La apertura del objetivo se utiliza para mejorar el contraste de la muestra. La lente intermedia magnifica la imagen de la lente objetivo. Finalmente, la lente del proyector amplifica aún más la imagen de la lente intermedia y la proyecta sobre una pantalla fosforescente.
Para optimizar las imágenes en un TEM, se debe realizar la alineación del haz antes de su uso. La herramienta utilizada para esta alineación es una rejilla porosa. La rejilla porosa es un soporte de rejilla TEM recubierto con una película plástica y una capa de carbono estable. Está fabricado para contener pequeños orificios circulares que pueden usarse para alinear el TEM. A medida que el haz de electrones se difracta alrededor del borde, los electrones se agrupan en el punto desenfocado y los agujeros en la rejilla crean franjas de Fresnel. Parece haber una banda o borde alrededor del borde del agujero.
La imagen final se ve proyectándola sobre una pantalla fosforescente, que emite fotones cuando es iluminada por un haz de electrones. La cámara cinematográfica se encuentra debajo de la pantalla fosforescente. La pantalla se eleva para exponer una película fotográfica especial que tiene una capa de emulsión más gruesa que la película sensible. Una alternativa a la película es filmar digitalmente utilizando una cámara digitalizada y archivada por computadora (CCD).
El operador es responsable de ajustar el sesgo variable, la identificación de aberraciones, la deriva de la imagen, la fotografía, el contraste de la muestra, la resolución, la iluminación uniforme y llenar el agente anticontaminación con nitrógeno líquido antes de usar el TEM.
El mantenimiento de instrumentos que requiere el servicio de los empleados o de la empresa incluye la saturación de filamentos, el reemplazo de filamentos, la limpieza o reemplazo de aperturas, la limpieza de portamuestras, el mantenimiento de bombas de vacío y las pantallas de observación.
La resolución teórica de la microscopía óptica descrita por Abbe se puede modificar y aplicar a TEM utilizando la fórmula de De Broglie. De Broglie afirmó que la longitud de onda del haz de electrones es función del voltaje de aceleración utilizado. Al aumentar el voltaje de aceleración, se pueden obtener longitudes de onda más cortas. El aumento de resolución se puede calcular aplicando longitudes de onda más cortas a la ecuación de Abbe. Los voltajes de aceleración típicos para bioTEM varían desde hasta 125.000 voltios.
Ecuación de Abbe: d = 0,753/aV 1 /2
pecado un
d = resolución (nm)
a = medio ángulo de apertura
V = velocidad de aceleración
La resolución se define como la distancia a la que se pueden distinguir dos puntos u objetos. Por lo tanto, cuando r tiende a cero, decimos que la resolución aumenta.
Oficial de Tokufurai:
l = hora/VM
h = constante de Planck
(6,626 x 10 –23 ergios/segundo)
m = masa del electrón
v = velocidad del electrón
La fórmula de De Broglie establece que si se aumenta el voltaje de aceleración, la velocidad del electrón aumentará y la resolución también aumentará.
Al igual que con la microscopía óptica, varios factores afectan este número. La aberración esférica también existe en TEM porque los electrones que pasan a través del perímetro de la lente se refractan más que los electrones que pasan a lo largo del eje. Por tanto, no todos los electrones llegan a un foco común. Para reducir la aberración esférica, se utiliza una apertura para eliminar algunos electrones periféricos.
A. b.
La gente no suele pensar que la aberración cromática sea un problema en la microscopía electrónica, pero la radiación electromagnética de diferentes energías se enfoca en diferentes planos focales. Este es esencialmente el mismo problema que la aberración cromática observada en la microscopía óptica. Para corregir la aberración cromática, aumente el voltaje de aceleración, mejore el vacío y/o utilice muestras más delgadas.
El astigmatismo ocurre cuando la intensidad del campo del cristalino no es simétrica, sino que es más débil en un plano que en otro. El astigmatismo puede ser causado por una perforación imperfecta de la pieza polar, una mezcla desigual de los materiales de la pieza polar o suciedad en la pieza polar, la abertura y/o el portamuestras. El antiastigmatismo se puede utilizar para aplicar un campo correctivo de intensidad adecuada en la dirección correcta para contrarrestar la asimetría. Los filtros de astigmatismo están ubicados en las lentes del objetivo y del condensador.
Aunque la difracción puede ser útil, la difracción de ondas de electrones alrededor de la abertura puede interferir con el frente de onda inicial. El resultado es una imagen poco clara o desenfocada. Es importante establecer un equilibrio entre la reducción de la aberración esférica y la difracción eligiendo una apertura del tamaño adecuado.
La formación de imágenes en microscopía electrónica se logra mediante dispersión de electrones. La interacción entre el haz de electrones primario y la muestra produce cambios en la energía y/o trayectoria pero no cambia su energía cinética. Los electrones retrodispersados son un ejemplo de dispersión elástica. La dispersión inelástica ocurre cuando los electrones transfieren parte de la energía cinética de los átomos de la muestra. Ejemplos de dispersión inelástica son los electrones secundarios, los electrones Auger y los electrones transmitidos.
Definición
Voltaje de aceleración : una cantidad fija de alto voltaje aplicada a la tapa del cátodo de un microscopio electrónico de transmisión.
Ánodo : Ubicado debajo del conjunto de la pistola, el ánodo está conectado a tierra y tiene un pequeño orificio para que se muevan los electrones. Esta apertura sirve como la primera lente que encuentran los electrones.
Astigmatismo : aberración causada por campos eléctricos desiguales alrededor de una lente.
Cátodo : el filamento o fuente de luz del haz de electrones primario. La tapa del cátodo (también llamada cilindro Wehnelt) rodea el conjunto de la pistola pulverizadora. Aquí se aplica alto voltaje.
Dedo frío : una larga varilla de cobre que recorre el interior de la columna de electrones. Cuando su depósito se llena con nitrógeno líquido, la varilla atrae contaminantes que de otro modo podrían reducir el vacío de la cámara.
Apertura del condensador : los orificios perforados con láser en tiras planas de molibdeno cerca del condensador ayudan a limitar la aberración esférica.
Lente convergente : la primera lente electromagnética encontrada por un haz de electrones. Enfoca los electrones en la muestra.
Aberración cromática: la radiación electromagnética de diferentes energías se enfoca en diferentes planos focales.
Cruce : el punto donde convergen los electrones. La imagen más pequeña del haz de luz visible en una pantalla fosforescente.
Fórmula de De Broglie : la longitud de onda de un electrón es función del voltaje de aceleración utilizado.
Bomba de difusión : la segunda bomba en serie durante la evacuación de la columna TEM.
Deriva : el aparente “movimiento” de un espécimen dentro del campo de visión.
Dispersión elástica : dispersión de electrones con poca pérdida de energía cinética pero un cambio significativo en la trayectoria del electrón.
Dispersión de electrones : la muestra desplaza el haz de electrones, formando una imagen.
Corriente de emisión : pequeña cantidad de calor agregada a una fuente de electrones para liberar electrones a través de la columna de electrones.
Franjas de Fresnel : patrones de difracción que se forman alrededor de pequeños agujeros cuando un haz de luz se enfoca excesivamente en el pequeño agujero.
Rejilla porosa : una película de soporte delgada con orificios que se pueden usar para alinear el TEM.
Dispersión inelástica: dispersión de electrones en la que pierden energía cinética pero cambian mínimamente su trayectoria.
Lente mediana : ayuda al objetivo a ampliar la muestra.
Apertura del objetivo : un orificio perforado con láser en una tira plana de molibdeno cerca de la lente del objetivo. Ajustar esta barra de apertura puede ayudar a ajustar el contraste de la imagen.
Lente objetivo : la lupa principal.
Pantalla fosforescente : pantalla ubicada en la base de la columna de electrones donde se puede ver la muestra.
Pieza polar : accesorio de latón dentro de una lente electromagnética que ayuda a estrechar el haz de electrones primario.
Lente de proyector : la última lente de un TEM. Se utiliza para ayudar a ampliar la imagen y proyectar la imagen ampliada en la pantalla de fósforo.
Bomba rotativa : también conocida como bomba de desbaste. La primera bomba de la serie de bombas de vacío.
Punto de saturación : el punto en el que la pistola alcanza una buena emisión de electrones sin acortar significativamente la vida útil del filamento.
Escudo : la carcasa de hierro dulce que rodea la lente electromagnética del TEM. Solenoide: lente electromagnética hecha de devanados de cobre a través de la cual fluye corriente continua.
Etapa de muestra : la plataforma sobre la que descansa la muestra durante la toma de imágenes.
Aberración esférica: los electrones que pasan por la periferia de una lente se refractan más que los electrones que pasan por el centro de la lente. Por tanto, los electrones no llegan a un foco común. Mejore agregando apertura.